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分子生物學常用技術及其應用 第一節(jié) 基因工程 一基因工程的基本概念 DNA重組——不同來源的DNA分子通過末端共價連接而形成重新組合的DNA分子的過程。 基因工程——采用人工方法將不同來源的DNA進行重組，并將重組后的DNA引入宿主細胞中進行增殖或表達的過程。 生物技術——包括基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、、細胞工程。 克隆——通過無性繁殖所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。 二、工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶：能從中間有選擇性地切割DNA分子特異序列。 DNA連接酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶多核苷酸激酶 堿性磷酸酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 三、載體 載體必須符合以下幾點要求： （1）能在宿主細胞內(nèi)復制并具有較高的拷貝數(shù) （2）容易進入宿主細胞 （3）具有多個限制性核酸內(nèi)切酶單一的酶切位點 （4）容易從宿主細胞中分離純化 （5）有容易被識別篩選的標志 常用的載體包括：質(zhì)粒、λ噬菌體、粘粒、病毒 五、重組DNA技術的基本過程 （一）制備目的基因和載體； （二）DNA的重組； （三）重組DNA導入宿主細胞 （四）DNA重組體的篩選和鑒定 （五）DNA重組體的 擴增和表達 （一）目的基因的 制備： 目的基因的篩選和分離可采用以下方法進行： 1．直接從染色體DNA中分離： 僅適用于原核生物基因的分離，較少采用。 2．人工合成： 根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進行人工合成。適應于編碼小分子多肽的基因。 3．從mRNA合成cDNA： 采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補DNA（cDNA），除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。這一方法通常可得到可表達的完整基因。 4．從基因文庫中篩選： 將某一種基因DNA用適當?shù)南拗泼盖袛嗪螅�與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為G文庫(genomic DNA library)。 將某種細胞的全部mRNA通過逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到含全部表達基因的種群，稱為C-文庫(cDNA library)。C-文庫具有組織細胞特異性。 5．利用PCR合成： (聚合酶鏈反應） 如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，在體外合成目的基因。 （二）目的基因與載體連接(DNA的重組）  主要通過DNA連接酶和雙鏈DNA粘性末端序列互補結(jié)合。 1、粘性末端連接 利用同種限制性內(nèi)切酶切開載體和DNA分子，能產(chǎn)生相同的粘性末端，在T4連接酶作用下遍可互補。 2、同聚物加尾連接 在酶的催化下人為在DNA鏈3‘末端添加多聚脫氧單核苷酸，制造粘性末端。 3、平末端連接 在 T4 DNA連接酶的作用下，直接連接DNA平端末端，效率較低。 4、人工接頭連接 在平端DNA末尾加上人工合成的具有限制性DNA內(nèi)切酶的DNA片段，再用內(nèi)切酶作用產(chǎn)生粘性末端。 （三）將外源性DNA導入宿主細胞 常用的方法兩種： 1、轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化——指將質(zhì)�；蚱渌�外源性DNA導入處于感受態(tài)的宿主細胞，并使其獲得新的表型的過程。 包括CaCl2制備感受態(tài)宿主細胞、法電穿孔法、顯微注射法、基因槍法等 2、感染 感染——以噬菌體進入宿主細胞或病毒進入宿主細胞中繁殖的過程。 用滅活的噬菌體或病毒的蛋白質(zhì)外殼包裹重組的DNA分子，使其進如宿主細胞。 （四）目的基因的篩選和鑒定 常用的方法包括：遺傳學方法、免疫學方法、核酸雜交法、PCR、核苷酸序列測定、DNA限制內(nèi)切酶圖譜分析法等。 遺傳學法：載體經(jīng)常帶有抗藥基因，利用含有該藥物的培養(yǎng)基直接分離。 分子雜交法：利用32P標記的探針與被檢對象進行雜交鑒定。 免疫學法：利用特異性抗體與基因表達產(chǎn)物結(jié)合的方法。 （五）克隆基因的表達 不同的目的基因在真核和原核表達體系中表達結(jié)果不同。 真核細胞可用于表達原核基因 原核細胞表達的真核基因產(chǎn)物還需要進一步加工處理，如甲基化、糖基化、折疊 六、基因工程在醫(yī)學中的應用 應用于醫(yī)學基礎研究 疾病的診斷和基因治療 生產(chǎn)基因工程藥物：既可改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)，提高產(chǎn)量，也可用于新蛋白類藥物的生產(chǎn)。 制造轉(zhuǎn)基因動物：可用于藥物蛋白生產(chǎn)、器官移植 人類基因工程組計劃 蛋白質(zhì)工程：通過基因工程改變蛋白質(zhì) 第二節(jié) 核酸的分子雜交 核酸分子雜交——依據(jù)兩條單核苷酸鏈之間的堿基互補、變性和復性的原理，用已知堿基序列的單鏈核苷酸片段作為探針，檢測待測樣品中是否存在與其互補的同源核苷酸序列的方法。 一、核酸分子雜交的基本原理 探針核酸分子與變性的被檢核酸分子復性，通過堿基互補的原則，形成雜交分子。 探針必須帶有標記，可用于定性和定量分析 （二）核酸分子雜交的基本方法 Southern印跡雜交 待測核酸是DNA片段，是DNA與DNA雜交，指將酶切并經(jīng)電泳分離的DNA片段固定在載體上，與探針進行雜交。 Northern印跡雜交 待測核酸是RNA片段，指將待測RNA經(jīng)分離后固定在載體上，與探針進行雜交。 斑點及狹縫印跡雜交 直接將變性核酸固定在載體上，用探針進行雜交。優(yōu)點是一張膜同時可用多種不同探針檢測 原位雜交 直接用探針和細胞內(nèi)的核酸進行雜交 三、探針的特征 （一）探針的特征 1、要帶有標記物 2、應是單鏈 3、具有高度的特異性 4、探針長段不一，短探針雜交速率快且特異性強 5、標記的探針應具有高度的靈敏性、穩(wěn)定、標記方法簡便、安全 （二）探針的種類與制備 1、基因組DNA探針——直接從基因組分離 2、cDNA探針——通過逆轉(zhuǎn)錄生成 3、寡核苷酸探針——人工聚合成 4、RNA探針——轉(zhuǎn)錄生成 （三）探針的標記物 放射性標記物：32P、35S、3H、125I、131I 非放射性標記物：生物素、地高辛、熒光素、酶 （四）標記方法 體內(nèi)標記法：將標記物摻入培養(yǎng)基 體外標記法：化學法或酶法 第三節(jié) 聚合酶鏈反應 polymerase chain reaction 聚合酶鏈反應（PCR） ——體外高效、快速、特異地擴增 目的基因或DNA片段的技術。 一、PCR 的基本原理 其原理類似于DNA的體內(nèi)復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復性及延伸的溫度與時間等，使目的DNA得以迅速擴增 二、過程（經(jīng)典操作過程）1、高溫變性（DNA模板變性） 與體內(nèi)DNA解鏈過程不同，PCR中作為模板的雙鏈DNA是通過95℃左右的高溫使其發(fā)生變性，形成單鏈DNA 2、低溫退火（模板與引物退火） PCR通常需要兩條寡核苷酸鏈作為DNA合成時的引物（primer），這兩個引物分別與待擴增模板DNA的目標片段兩端的序列互補。在降低溫度的過程中（一般為70-75 ℃ ，通過控制退火條件，引物就能準確地與擴增區(qū)域的兩端配對。 ⑴引物短，不易纏繞； ⑵設計的引物是與模板DNA兩端序列互補； ⑶引物的量遠大于模板分子的量，引物與模板DNA形成雙鏈的幾率遠遠高于DNA分子自身的復性。 3、適溫延伸（72 ℃） 在PCR反應體系中的DNA聚合酶，能夠催化反應體系中游離的單核苷酸（dNTPs）由引物5'→3'方向，按堿基配對的原則延伸，形成兩條與模板DNA互補的復制鏈。 熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán) 每一循環(huán)后的模板均比前一循環(huán)增加1倍。理論上講，擴增DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的，即n個循環(huán)后，產(chǎn)量為2n拷貝。而實際上，PCR的擴增倍數(shù)為（1+X）n，X為擴增效率，平均為75% 盡管PCR擴增DNA非常有效，但目的DNA序列的指數(shù)擴增并不是一個無限制的過程。 在正常的反應條件下，經(jīng)30次循環(huán)之后，酶的催化反應趨于飽和，就會出現(xiàn)平臺效應 (Plateau) ，產(chǎn)物的量不再增加。 “平臺效應”出現(xiàn)的遲早還取決于酶的性能、模板DNA的拷貝數(shù)、dNTP濃度等多種因素。 RT—PCR 以mRNA為原始模板的PCR，亦稱逆轉(zhuǎn)錄PCR。 逆轉(zhuǎn)錄反應在42 ℃進行，隨后將反應混合物加熱至95 ℃5min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，取2ul反應產(chǎn)物，按DNA為模板的PCR反應步驟，進行擴增反應。 第四節(jié) DNA芯片技術 綜合了分子生物學、微電子學、微加工和計算機等學科知識 本質(zhì)：在固定的玻片等載體上的微型生物化學分析系統(tǒng)，芯片上每平方厘米可排列成千上萬生物分子，能快速準確地檢測核酸，并獲取樣品中的有關信息。 一、DNA芯片技術的概念和主要類型 DNA芯片技術——指將大量已知寡核苷酸或DNA探針（不標記）按特定的排列方式固化在固相支持物（多用計算機硅芯片）表面，按堿基互補配對的原則，與標記的特異的單鏈DNA或RNA（待測樣品）分子雜交形成雙鏈，通過對雜交信號的檢測分析，得出樣品分子的數(shù)量和序列信息。 DNA芯片主要類型 原位合成芯片 才用光介導和壓電打印等技術在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片 DNA微集陣列 將預先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片 二、DNA芯片技術的基本原理與方法 DNA芯片技術工作流程主要包括： 芯片制備——關鍵 樣品的準備與標記 雜交 信號檢測和數(shù)據(jù)分析處理 （一）、芯片的制備 1、支持物的預處理 支持物包括實性材料和膜性材料 實性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等 實性材料需要進行預處理，使其表面衍生出羥基、氨基等活性基團，并在表面用光敏材料保護。 膜性材料包括聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維素膜等 膜性材料則要包被氨基硅烷或多聚賴氨酸。 2、原位合成芯片的制備 兩種方法：光介導原位合成法、壓電打印合成法 利用排列組合的原理，在一塊載體的不同位置合成不同的寡核苷酸片段 3、DNA微集陣列的制備 包括制備探針、打印、探針固化三個步驟 （二）樣品的準備 包括分離純化、擴增和標記 （三）分子雜交 一般30分鐘內(nèi)完成 （四）檢測分析 根據(jù)產(chǎn)生的熒光強度分析樣品含量及樣品結(jié)合的探針類型，最后分析樣品核苷酸序列。 三、DNA芯片技術的應用（自學） DNA序列測定 突變及多態(tài)性分析 基因表達分析 基因組研究 基因診斷 藥物研究與開發(fā) 第五節(jié) 基因診斷和基因治療 基因診斷——以DAN或RNA為診斷材料，DNA反映基因的存在狀態(tài)、RNA反映基因的表達狀態(tài)，通過檢查基因的存在、缺陷或表達異常。 常用的方法：包括核酸分子雜交、PCR、單鏈構象多態(tài)性檢測、限制性內(nèi)切酶酶譜分析、DNA序列測定、DNA芯片技術 基因治療——指以正�；�因矯正、替代缺陷基因，或從基因水平調(diào)控細胞中缺陷基因的表達的一種治療疾病的方法。 基本過程： 1、選擇制備目的基因 2、選擇基因轉(zhuǎn)運載體 3、選擇靶細胞 4、轉(zhuǎn)移基因 5、外源基因表達的篩選 6、回輸細胞到體內(nèi)CkW紅軟基地

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