這是一個關于激光共聚焦顯微鏡教程PPT課件，包括了激光掃描共聚焦顯微鏡，發(fā)展歷史，激光共聚焦顯微鏡的基本原理，LSCM的基本組成，基本結構——激光光源，激光光源的產生，掃描器系統(tǒng)，熒光顯微鏡系統(tǒng)，計算機系統(tǒng)，基本功能，組織和細胞中的熒光來源，熒光探針，熒光樣品的制備要求，熒光探針標記的注意事項，LSCM的優(yōu)越性，LSCM在生物醫(yī)學中的應用，原位檢測細胞中的核酸，熒光原位雜交（FISH），原位檢測蛋白質及其它分子，熒光蛋白：跟蹤組織或細胞內基因表達及蛋白定位的標記物，檢測細胞凋亡，檢測細胞器，LSCM在生物醫(yī)學中的應用，游離鈣離子變化熒光探針，藥物進入細胞的動態(tài)過程及定位分布，熒光漂白技術，熒光共振能量轉移（FRET)，LSCM在生物醫(yī)學中的應用，超微結構復習題，共聚焦實驗分組，電鏡觀察分組等內容，激光共聚焦顯微鏡原理和應用激光掃描共聚焦顯微鏡 LSCM Laser scanning confocal microscope 發(fā)展歷史 1957年，Malwin Minsky在其專利中首次闡明了激光共聚焦顯微鏡技術的基本工作原理， 1967年，Egger第一次成功能共聚焦顯微鏡產生了一個光學橫斷面， 1970年，Sheppard和Wilson 推出第一臺單光束共聚集激光掃描顯微鏡 1987年，White 和Amos在Nature雜志發(fā)表了“Confocal microscopy come of age”,標志著LSCM已成為科學研究的重要工具。普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡圖像的差別 激光共聚焦顯微鏡的基本原理 LSCM的基本組成激光發(fā)射器顯微鏡部分掃描裝置計算機系統(tǒng)基本結構——激光光源 LASER “Light amplification by stimulated emission of radiation” 受激發(fā)射的輻射光放大，歡迎點擊下載激光共聚焦顯微鏡教程PPT課件。

激光共聚焦顯微鏡教程PPT課件是由紅軟PPT免費下載網推薦的一款儀器設備PPT類型的PowerPoint.

激光共聚焦顯微鏡原理和應用激光掃描共聚焦顯微鏡 LSCM Laser scanning confocal microscope 發(fā)展歷史 1957年，Malwin Minsky在其專利中首次闡明了激光共聚焦顯微鏡技術的基本工作原理， 1967年，Egger第一次成功能共聚焦顯微鏡產生了一個光學橫斷面， 1970年，Sheppard和Wilson 推出第一臺單光束共聚集激光掃描顯微鏡 1987年，White 和Amos在Nature雜志發(fā)表了“Confocal microscopy come of age”，標志著LSCM已成為科學研究的重要工具。普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡圖像的差別 激光共聚焦顯微鏡的基本原理 LSCM的基本組成激光發(fā)射器顯微鏡部分掃描裝置計算機系統(tǒng)基本結構——激光光源 LASER “Light amplification by stimulated emission of radiation” 受激發(fā)射的輻射光放大。激光光源的產生受激吸收：處于較低能級的粒子在受到外界的激發(fā)（即與其他的粒子發(fā)生了有能量交換的相互作用，如與光子發(fā)生非彈性碰撞），吸收了能量時，躍遷到與此能量相對應的較高能級。 自發(fā)輻射 ：粒子受到激發(fā)而進入的激發(fā)態(tài)，不是粒子的穩(wěn)定狀態(tài)，自發(fā)地從高能級激發(fā)態(tài)（E2）向低能級（E1）躍遷，同時產生光輻射的過程。 眾多原子以自發(fā)輻射發(fā)出的光，不具有相位、偏振態(tài)、傳播方向上的一致，是物理上所說的非相干光。 受激輻射：除自發(fā)輻射外，處于高能級E2上的粒子還可以另一方式躍遷到較低能級。當一個外來光子帶來的能量正好對應能級差時（E2-E1），也會引發(fā)粒子以一定的概率，迅速地從能級E2躍遷到能級E1，同時輻射一個與外來光子頻率、相位、偏振態(tài)以及傳播方向都相同的光子的過程。激光光源的產生單色性好方向性好亮度高相干和偏振性好 掃描器系統(tǒng)針孔：confocal一個重要組成部分，它是放在檢測器及激光光源前面的一個小孔，作用是控制光切片的厚度，對實現(xiàn)斷層掃描成像，排除焦面雜散光起關鍵作用 分光鏡：作用是按照波長來改變光線的傳播方向。 發(fā)射熒光分色鏡：作用是選擇出一定的波長范圍的光進行檢測，不同型號的儀器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色器的部件主要由濾光片、棱鏡和光柵三種類型。 檢測器：采用高靈敏度的光電倍增管，其檢測的范圍和靈敏度可根據(jù)強度進行連續(xù)調節(jié)。 熒光顯微鏡系統(tǒng)類型：正置，倒置光路： 光源：汞燈、氙燈，觀察分辨樣品中產生熒光物質的成分與位置。 源發(fā)濾光片：選擇適合熒光物質激發(fā)波波長的范圍 雙色分光鏡：初步分開激發(fā)和發(fā)射光組件、 阻濾片：獲得更純的發(fā)射熒光 物鏡：激發(fā)和發(fā)射都由同一物鏡實現(xiàn)。 目鏡：10 × 用于LSCM的熒光顯微鏡：側面有掃描器接口，裝有微量步進馬達，有防振裝置，有光路轉換裝置，配高數(shù)值孔徑的物鏡。 計算機系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、處理、轉換、應用軟件 基本功能多種圖像掃描方式 2D: xy，xz，xt 3D：XYZ，Xyt 4D：XYZt 光譜掃描多色熒光同時檢測：圖像分析與定量處理： 3D重建，立體重建，斷面輪廓分析。圖像分析：特定區(qū)域的強度、周長的測量，以及延時觀察分析t等。熒光光譜拆分組織和細胞中的熒光來源自發(fā)熒光：指組織細胞不經過任何熒光染色便能在短波長光的激發(fā)下發(fā)射出的熒光，GFP就具有自發(fā)熒光，是標記靶蛋白的特異性熒光探針。熒光染色：很多熒光染料與組織細胞作用，能夠在光的作用發(fā)出特征波長的熒光，借以觀察組織細胞的形態(tài)結構、化學組成和功能。有些可做活體染色。免疫熒光：熒光抗體法產生熒光。外源性熒光物質進入組織內產生的熒光。某些藥物誘發(fā)熒光：生物胺類能與某些醛類物質在一定條件下縮合而發(fā)生熒光。酶致熒光：某些酶的反應能夠發(fā)射熒光。熒光探針熒光標記與熒光探針：采用一定的標記物，使樣品待測物質具有特定的熒光特征，這種標記物被稱為熒光探針。這種組樣品賦予特征熒光的操作過程稱為熒光標記。 熒光探針的種類：蛋白質、單糖和多糖探針，細胞器探針、核酸探針、細胞活性探針、膜結合受體探針等。 如何選擇探針根據(jù)實驗目的確定需要檢定的指標 確定可供選擇的熒光探針的范圍：根據(jù)需要檢測的指標，選擇應成熟的探針或標記方法�？赏ㄟ^查找文獻和試劑公司產品目錄確定可以標記待測物的熒光探針的種類或范圍。 考慮熒光探針的特性：熒光探針與樣品的反應特性（與待測分子或離子反應的選擇性或專一性等），熒光探針的靈敏度和熒光強度，熒光探針標記后樣品的光譜特征（需要在儀器的檢測范圍內），熒光的穩(wěn)定性，樣品中多重熒光的相互影響（避免光譜交叉）。熒光樣品的制備要求熒光標記反應特異性強，熒光信號定位準確保持樣品應有的形態(tài)結構的完整性熒光信號響應百準確靈敏，具有可重復性熒光強度適度熒光穩(wěn)定性好。樣品的熒光分布均勻兩種或兩種以上的熒光信號之間熒光光譜交叉可以得到消除。圖象背景干凈，干擾雜質少。 熒光樣品的制備過程樣品的預處理 用熒光探針標記樣品 熒光探針標記的注意事項熒光強度過高：看不清細胞結構細節(jié)，不利于形態(tài)觀察，可降低探針濃度，減少反應時間。熒光強度弱：熒光探針濃度過低，標記條件不當，探針溶解不充分，探針選擇錯誤等。在操作過程中，避免對樣品造成損傷防止影響實驗結果熒光標記要避光進行。防止非特異性標記，設立正確的對照組。熒光標記后要盡快上機采集圖像。 LSCM的優(yōu)越性動態(tài)連續(xù)掃描及三維圖像重組 LSCM可以對對活細胞和組織或細胞切片樣品的不同層面進行連續(xù)逐層掃描， 來獲得各個層面的圖像，即所謂的“無損傷的光學切片”。激光掃描共聚焦顯微鏡掃描的每個層面之間的間距可以達到0.1um甚至更小。獲得的圖像通過計算機重組，可獲得精細的細胞骨架、染色體、細胞器和細胞膜系統(tǒng)的三維圖像。與普通光學顯微鏡獲得的圖像相比，LSCM所得 到的重組三維圖像清晰度高、立體感強， 可通過計算機軟件對細胞內所研究的結構進行各種測量，對細胞內的空間結構和某些物質在細胞內的定位方面的研究中有廣泛的應用。 LSCM的優(yōu)越性同時多種物質標記 利用LSCM，通過對膜上、胞漿內多種物質的熒光標記，可以實現(xiàn)在同一樣品上同時進行多重物質的觀察，比如檢測細胞內鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率及動態(tài)變化 LSCM的優(yōu)越性瞬時分辨率高 可以實時動態(tài)觀察活體組織標本。LSCM 的熒光檢測器可以毫秒級或微秒級的速度檢測熒光，即其時間分辨率極高，能對細胞內的分子進行功能性動態(tài)觀察。LSCM技術可對活細胞在無損傷處理的情況下進行觀察，跟蹤活細胞內的物質或結構和生理過程隨時間變化的情況，得到實時動態(tài)的連續(xù)圖像。 LSCM的優(yōu)越性高質量數(shù)字圖像 普通顯微鏡采用的自然光或燈光是一種場光源，標本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射光或散射光的干擾。LSCM以激光為光源，激光具有單色性強、方向性好、高亮度﹑相干性好等優(yōu)點，可以避免普通顯微鏡的缺點。一般常用的氣體激光器如氬(Ar)﹑氪(Kr)﹑氦(He)﹑氖(Ne)。由于LSCM的樣品焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，這樣就避免了傳統(tǒng)光學顯微鏡由于光散射造成的圖像信噪比降低，圖像清晰度和分辨率不高的缺點。而且，LSCM的圖像是以電信號的形式記錄下來的，可以采用各種模擬的和數(shù)字的電子技術進行各種圖像處理。 LSCM在生物醫(yī)學中的應用組織和細胞中分子或結構的定位，定量分析：利用LSCM可以在細胞原位用特異的熒光標記探針標記出核酸、蛋白質、多肽、酶、激素、磷脂、多糖、受體等分子，實現(xiàn)對其定位、定性和定量檢測，也可觀察細胞及亞細胞形態(tài)結構。如在細胞原位檢測核酸、原位檢測蛋白，抗體及其他分子，檢測細胞凋亡、細胞器觀察及測定，檢測細胞整合、觀察細胞骨架，檢測細胞間縫隙連接通訊等多種應用。標本的制備方法主要有免疫熒光組織和細胞化學法、熒光蛋白標記分子法，熒光細胞染料標記法等。LSCM不但可對單標記或雙標記細胞及組織標本的共聚焦熒光進行定量分析，還可利用沿縱軸上移動標本進行多個光學切片的疊加形成組織或細胞中熒光標記結構的總體圖像，以顯示熒光在形態(tài)結構上的精確定位。原位檢測細胞中的核酸用于細胞核的定位及形態(tài)學觀察，檢測細胞內DNA的復制及斷裂情況以及染色體定位觀察等。 常的熒光探針： PI，EB，DAPI， AO， TOTO-1等熒光原位雜交（FISH）利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進行檢測的技術。用標記有熒光的DNA或RNA為探針，在原位測組織細胞內特定的DNA或RNA片斷，從而對染色體或基因異常的細胞、組織樣本進行檢測和診斷。把熒光信號的高靈敏度、安全性、直觀性和原位雜交的高準確性結合起來。原位檢測蛋白質及其它分子常用熒光探針 FITC，TRITC， Cy3，Cy5等免疫熒光標記：將抗體標記上熒光素，與細胞或組織內相應的抗原結合后，通過檢測特征性的熒光，定位，定性、定量檢測樣品中的抗體。既有免疫反應的特異性，又有熒光檢測的敏感性。 熒光蛋白：跟蹤組織或細胞內基因表達及蛋白定位的標記物 GFP，綠色熒光蛋白，在任何活細胞中都表達，可作為活細胞的分子探針，GFP連接上目的基因后轉染細胞，可分析目的基因的生物學功能和特性�？蓪�活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態(tài)觀察，可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時空表達，如某種轉錄因子的核轉位，蛋白激酶C的膜轉位，還可用于觀察分子的運動，及蛋白之間的相互作用。檢測細胞凋亡 Annexin V/PI雙染：Annexin V是檢測凋亡早期細胞膜損傷的方法，凋亡早期細胞膜膜磷脂失去平衡，細胞膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）會從細胞內側翻轉到外側，暴露于細胞外環(huán)境中，Annexin V與磷脂具有高度親和力，可與轉移到膜外的PS結合。對于凋亡晚期細胞和死細胞，PI能透膜而使其染紅。兩者配合使用可以初步確定細胞的凋亡進程。 檢測細胞器標記線粒體：Rodamin 123，JC1， Mitotracker Green FM， Mito Tracker Red 標記溶酶體：Lyso tracker green，Lyso tracker blue， Lyso tracker red 標記內質網：DiOC6 標記高爾基體：NBD C6-ceramine 斑馬魚腦部的血管與神經元 綠色：神經元 紅色：血管藍色細胞核， 綠色微管 LSCM在生物醫(yī)學中的應用活體細胞和組織功能的實時動態(tài)監(jiān)測：利用相應的特異性熒光標記所要觀察的物質后，用LSCM可實時動態(tài)監(jiān)測單個細胞不同部位或不同組織區(qū)域接受刺激后的整個變化過程。如：實時定量測定細胞內Ca離子的變化，測定細胞內PH變化、檢測膜電位的變化、檢測細胞內活性氧物種的產生、檢測藥物等跨膜進入組織或細胞過程及其定位、檢測熒光共振能量轉移(FRET)、等多種對活細胞的實時動態(tài)監(jiān)測。游離鈣離子變化熒光探針此類探針多為鈣離子螯合劑，可用常用的探針Fluo-3，其乙酰羥甲基酯(AM)形式為不帶電荷的親脂性化合物，易于滲透脂膜進入活細胞內，在胞內被非特異酯酶水解，釋放出無熒光的游離酸形式的熒光探針分子，探針分子一旦與Ca離子結合便形成復合物，并產生較強的熒光，從而發(fā)揮其鈣探針的作用 。一般來說，電生理記錄裝置加攝像技術檢測細胞內離子量變化的速度相對較快，但其圖像本身的價值較低，而LSCM可以提供更好的亞細胞結構中鈣離子濃度動態(tài)變化的圖像。 常用探針Fluo-3-AM，Indo-1， Fura-2，Calcium Green-1， Calcium Green-2等。 藥物進入細胞的動態(tài)過程及定位分布為檢測藥物分子、病毒、細菌等外界物質能否跨膜進入細胞（或組織），需要利用這些物質特異性的自發(fā)熒光或對其進行熒光標記。這些具有熒光的物質與細胞（或組織）充分作用后，如果與細胞（或組織）結合，則細胞（或組織）中會有特征熒光出現(xiàn)，利用激光共聚集顯微鏡檢測細胞（或組織）內該熒光出現(xiàn)的位置和含量，還可檢測該物質跨膜進入細胞的動態(tài)過程。熒光漂白技術原理：使用強激光照射，將細胞內的一個區(qū)域的熒光分子漂白，然后觀察未漂白的熒光分子的運動。GFP較適合用于光漂白研究的熒光分子：它比較亮，穩(wěn)定，在活細胞內沒有毒性，在使用低激光強度拍攝圖像時漂白較少，其次，在使用高強度激光照射時，GFP的光漂白是非可逆的，并且GFP的光漂白不會造成細胞損傷，另外，分子融合技術將GFP與特定蛋白分子融合，使得光漂白技術可用于研究蛋白分子在細胞內的運動。 兩種漂白實驗：一是熒光漂白丟失（FLIP），觀察漂白后的熒光丟失現(xiàn)象；二是熒光漂白恢復（FRAP），觀察的熒光恢復現(xiàn)象。熒光漂白丟失FLIP 將細胞內一個區(qū)域的熒光分子反復漂白，然后觀察漂白區(qū)域外熒光丟失的情況。可以研究不同部位的熒光分子的轉運或連續(xù)性，如GFP整合蛋白分子在不同細胞器內的分布等。熒光漂白恢復（FRAP） FRAP是利用高能量激光束將細胞內某一部分中選定靶區(qū)域的某種熒光淬滅，然后觀察鄰近相同的非淬滅熒光標記物重新擴散入該區(qū)域的速度和方式，從而分析細胞內蛋白質運輸、受體在細胞膜上的流動和大分子組裝等細胞生物學過程。熒光共振能量轉移（FRET) 用于研究細胞內蛋白質分子間或蛋白質分子內的相互作用�？梢垣@得兩個蛋白分子之間相互作用的空間信息。關于蛋白分子的共定位，蛋白分子聚合體，轉錄機制，蛋白折疊等問題可通過FRET來解決。 LSCM在生物醫(yī)學中的應用長時程觀察細胞遷移和生長：目前的LSCM的軟件一般均可自動控制進行定時和定方式的激光掃描，新一代的LSCM探測效率提高，只需很小激光量就可達到較好的圖像質量，從而減小了每次掃描時激光束對細胞的損傷，因此可以用于數(shù)小時的長時間的定時掃描，記錄細胞遷移和生長等細胞生物學現(xiàn)象。激光共聚焦顯微鏡在各研究領域中應用細胞生物學：細胞結構、細胞骨架、細胞膜結構、流動性、受體、細胞器結構和分布變化、細胞凋亡等；  生物化學：酶、核酸、 FISH 、受體分析等；藥理學：藥物對細胞的作用及其動力學等；生理學：膜受體、離子通道、離子含量、分布、動態(tài)等；遺傳學和組胚學：細胞生長、分化、成熟變化、細胞的三維結構、染色體分析、基因表達、基因診斷等；  神經生物學：神經細胞結構、神經遞質的成分、運輸和傳遞等；  微生物學和寄生蟲學：細菌、寄生蟲形態(tài)結構等；  病理學及病理學臨床應用：活檢標本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷等；  生物學、免疫學、環(huán)境醫(yī)學和營養(yǎng)學：免疫熒光標記（單標、雙標）的定位，細胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細胞器的共定位等。 復習題 LSCM成像原理 簡述LSCM在生物醫(yī)學中的應用超微結構復習題簡述細胞核，線粒體，高爾基體，內質網，細胞膜，溶酶體的基本結構。線粒體嵴的類型、結構特點和意義線粒體腫脹和積水變，嵴內腫脹，線粒體肥大和增生，巨線粒體常見的線粒體、內質網包含物 粗面內質網肥大和增生的形態(tài)特征 粗面內質網脫粒和多聚核糖體解聚形態(tài)特征和意義微絨毛 形態(tài)特征 纖毛 形態(tài)特征 常見的病理改變類型常見的細胞連接類型，基本結構核體次級溶酶體的分類 共聚焦實驗分組電鏡觀察分組MZh紅軟基地

激光共聚焦顯微鏡PPT課件：這是一個關于激光共聚焦顯微鏡PPT課件，包括了激光掃描共聚焦顯微鏡成像的基本原理，激光掃描共聚焦顯微鏡的基本結構，激光掃描共聚焦顯微鏡的應用，量子點技術及其在生命科學研究中的應用等內容。激光掃描共聚焦顯微鏡技術（Laser scanning Confocal Microscopy，簡稱LSCM）是近代生物醫(yī)學圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，利用計算機進行圖象處理，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖象，以及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化。廣泛應用于細胞生物學、生理學、病理學、解剖學、組織胚胎學、免疫學和神經生物學等領域，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研究具有很大的優(yōu)越性，為這些領域新一代強有力的研究工具，歡迎點擊下載激光共聚焦顯微鏡PPT課件。