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第四章 核酸雜交技術(shù) 目 錄 第一節(jié) 核酸分子雜交的概念 一、核酸探針 二、分子雜交信號檢測 第二節(jié) 經(jīng)典的核酸分子雜交技術(shù) 一、固相雜交 二、液相雜交 目 錄 核酸分子雜交(molecular hybridization of nucleic acid) 核酸分子雜交：單鏈的核酸分子在合適的條件下，與具有堿基互補序列的異源核酸形成雙鏈雜交體的過程。 核酸分子雜交技術(shù)：利用核酸分子雜交檢測靶序列的一類技術(shù)稱核酸分子雜交技術(shù)。 核酸分子雜交技術(shù)目前應(yīng)用廣泛，是定性或定量檢測特異RNA或DNA序列片段的有力工具。 第一節(jié) 核酸分子雜交的概念 2、融解溫度 (Melting Temperature， Tm)定義：在DNA熱變性時，其A260的升高達(dá)最大值一半時的溫度。 重點提示 分子雜交：指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補配對原則經(jīng)過退火處理，形成異質(zhì)雙鏈的過程。利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。 一、核酸探針 核酸探針指能與靶核酸序列發(fā)生堿基互補雜交，并能由其標(biāo)記被特異性檢測的核酸分子。 1. DNA探針 最常用的核酸探針 2.RNA探針 3.寡核苷酸探針 （二）探針的長度 （三）核酸探針的標(biāo)記 不同標(biāo)記類型探針的比較： 2.探針標(biāo)記方法的選擇 二、分子雜交信號檢測 （一）放射性標(biāo)記探針檢測 2.液體閃爍計數(shù)法 （二）非放射性標(biāo)記探針的雜交檢測 化學(xué)發(fā)光是指化學(xué)反應(yīng)中釋放的能量以光的形式發(fā)射出來形成檢測信號。 化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中目前常用的酶有堿性磷酸酶及辣根過氧化物酶 發(fā)射光線的強度反映了酶的活性，反應(yīng)了雜化分子的量。 采用發(fā)色體檢測的最大益處是可同時檢測一個以上的雜化分子 每種探針分別用不同的報告基團(tuán)如生物素、熒光素和地高辛標(biāo)記并同時與固定在濾膜上的核酸雜交 采用不同的鏈霉抗生素或抗體-酶和相應(yīng)底物組合 核酸分子雜交分類 分子雜交技術(shù)一般過程 ☆ 探針制備及標(biāo)記（同位素或非同位素） ☆ 待測核酸樣品制備（分離，純化） ☆ 雜交（液相，固相，原位雜交） ☆ 雜交后處理（去掉非特異雜交分子） ☆ 顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影） ☆ 結(jié)果分析 固相雜交： （一）反向點雜交 （二）Southern印跡雜交 （二）Southern印跡雜交 Southern雜交的應(yīng)用 Northern雜交應(yīng)用 二、液相雜交 液相雜交 三、原位雜交 （一）基本操作步驟： 雜交前準(zhǔn)備：保持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、保存核酸、增加組織的通透性、減低背景。 雜交：使探針與細(xì)胞中的把序列結(jié)合。 雜交后處理：鹽溶液的漂洗，以減少背景。 顯示：根據(jù)核酸探針標(biāo)志物的種類選擇相應(yīng)的檢測系統(tǒng)。  （二）原位雜交的應(yīng)用 1. 細(xì)胞遺傳學(xué)分析 產(chǎn)前診斷 生殖醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 血液疾病中染色體易位的檢測 實體瘤研究 2. 比較基因組雜交 3. 基因圖譜繪制 4. 病原學(xué)檢測 核酸分子雜交技術(shù)類型 一、探針的選擇 二、探針的標(biāo)記方法 三、探針的濃度 四、雜交率 五、雜交溫度 六、雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性 七、雜交反應(yīng)時間 八、雜交促進(jìn)劑ABF紅軟基地

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