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限 制 性 內(nèi) 切 酶 細(xì)菌可以抵御病毒的入侵，而這種“限制”病毒生存的辦法則可歸功于細(xì)胞內(nèi)部可摧毀外源DNA的限制性內(nèi)切酶。 從表1可看出，從三種不同的E.coli菌株中繁殖出來的λ噬菌體的后代(分別用λK、λ B 、λC表示)，再接種到同樣菌株，接種效率都是1。 但如果接種到不同的菌株中，如λK在B株上接種效率只有10-4，而不管λK還是λB在C株上的接種效率都為1。 原來，E.coli K株和B株都各自含有一種限制修飾系統(tǒng)，其限制性內(nèi)切酶能將外來DNA切斷。 ——限制 每一種內(nèi)切酶在DNA上都有一定的結(jié)合位點(diǎn)。菌株本身的DNA也含有這樣的結(jié)合位點(diǎn)時，該菌株的甲基化酶就在這些識別位點(diǎn)上將腺嘌呤甲基化(成為N6—甲基腺嘌呤)；或者將胞嘧啶甲基化(成為5—甲基胞嘧啶)。這樣限制性內(nèi)切酶就不會將自身的DNA降解掉。 ——修飾 這兩方面作用結(jié)合起來，就稱為限制—修飾作用。 限制-修飾（R-M）系統(tǒng) 限制性內(nèi)切酶常常伴隨一到兩種修飾酶（甲基化酶）出現(xiàn)。后者的作用是保護(hù)細(xì)胞自身DNA不被限制性內(nèi)切酶破壞。修飾酶識別位點(diǎn)與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶相同，但只甲基化每條鏈中的一個堿基，甲基基團(tuán)伸入到雙螺旋的大溝中去，阻礙了限制性內(nèi)切酶的作用。限制性內(nèi)切酶和它的甲基化酶一起構(gòu)成了限制-修飾（R-M）系統(tǒng)。 在一些R-M系統(tǒng)中，限制性內(nèi)切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，各自獨(dú)立行使自己的功能；而在另一些系統(tǒng)中，兩種功能由同一種酶的不同亞基，或是同一亞基的不同結(jié)構(gòu)域來執(zhí)行。 不同的菌株可能有不同的限制修飾系統(tǒng)。當(dāng)不同來源的噬菌體λ進(jìn)入另一種大腸桿菌時，絕大部分被限制酶所降解，但有極少數(shù)的入噬菌體先被大腸桿菌的甲基化 酶所修飾，因而幸存下來. 大腸桿菌C株沒有限制酶，因而其他來源的λ可以感染C株，而C株來源的λ不能感染K株和B株。這樣，細(xì)菌借助于限制—修飾系統(tǒng)，就能區(qū)別自我DNA和外源DNA。 表1中所列僅是第一輪接種效率。如果將那些10-4幸存者的后代噬菌體再接種到第一輪同樣的E.coli菌株中，如λ K→B→B，則接種效率也為100％，然而，如果將萬分之一幸存者的后代接種到祖輩噬菌體的寄主菌株中心， λ K → B → K，則接種效率也成為10-4 ，為什么? Answer: 幸存者的后代因?yàn)橛行录闹鞯男揎棙?biāo)記而缺少祖代寄主的修飾標(biāo)記，只能感染新的寄主類型，而不再能感染祖代寄主。 這里所謂自我DNA和外源DNA是對于它的限制—修飾模式而言， 凡限制—修飾模式相同的DNA均為自我DNA，這包括同株系不同個體的DNA，及寄生于這些菌株中的質(zhì)粒和噬菌體。 在同一個細(xì)胞內(nèi)的不同類型的DNA，包括細(xì)胞DNA，質(zhì)粒DNA，噬菌體DNA等，都具有同樣限制—修飾模式。這些同一細(xì)胞中的不同DNA可統(tǒng)稱為該細(xì)胞中的居民DNA(resident DNA)。 事實(shí)上，有些菌株的細(xì)胞染色體并沒有限制—修飾系統(tǒng)的基因，其限制修飾系統(tǒng)是由其中的質(zhì)粒或噬菌體的基因所編碼的。因此有的不同菌株的差別不在于細(xì)菌本身，而在它所含的質(zhì)�；蚴删�體的不同。 We can envision two types of methylation events. The first involves the methylation of host genome sequences after they have replicated. The two daughter genome molecules contain one methylated strand (the parental template strand) and one newly synthesized strand . These hemi-methylated sites are very efficiently methylated by the host modification enyzmes. The secont type involve the methylation of completely unmethylated sites. Unmethylated sites may occur during very rapid cell division - but they are normally rare. De-novo methylation of totally unmethylated sites is an extremely inefficient process. This accounts for the low efficiency of phage infection in a new host strain. The majority of incoming phage genomes are recognized by the restriction endonucleases (999 out of 1000) while only the rare infection (1 in 1000) is methylated before it is recognized by the host restriciton enzymes. Once methylated however， all subsequent phage genomes are efficiently methylated at hemi-methylated sites on replication. This explains the high efficiency infection with the individual plaques that escaped restriction. 首批被發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶包括來源于大腸桿菌的EcoR I和EcoR II，以及來源于Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。這些酶可在特定位點(diǎn)切開DNA，產(chǎn)生可體外連接的基因片段。研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因組成、功能及表達(dá)非常有用的工具。 限制性酶的命名：根據(jù)分離出此酶的微生物學(xué)名而定。取微生物屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成三個斜體字母，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后發(fā)現(xiàn)幾個不同的酶，則用羅馬數(shù)字加以表示。例如大腸桿菌的Eco RI，R表示株名，I表示該菌中第一個被分離出來的酶。 已純化分類3000種限制性內(nèi)切酶； 已發(fā)現(xiàn)了超過250種的特異識別序列。 限制性內(nèi)切酶的主要功能是保護(hù)細(xì)菌不受噬菌體的感染。 當(dāng)一個沒有限制性內(nèi)切酶的細(xì)菌被病毒感染時，大部分病毒顆粒都能成功地進(jìn)行感染。然而一個有限制性內(nèi)切酶的同種細(xì)菌被成功感染的比率顯著下降。 出現(xiàn)更多的限制性內(nèi)切酶將會起到多重保護(hù)作用；而一個擁有4到5種各自獨(dú)立的限制性內(nèi)切酶將會使細(xì)胞堅(jiān)不可摧。 一、限制性內(nèi)切酶分類 傳統(tǒng)上將限制性內(nèi)切酶劃分為三大類 type I、typeⅢ：它們的限制酶和甲基化酶都作為亞基包含在同一個酶分子中。 typeⅡ：它與相應(yīng)的甲基化酶是分開的；不屬同一個酶分子。在重組DNA技術(shù)和生化分析技術(shù)中所常用的限制性內(nèi)切酶均為二類限制酶。  I 型限制性內(nèi)切酶 是一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的多個亞基的蛋白復(fù)合體。它們在識別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈。 III型限制性內(nèi)切酶 也是兼有限制-修飾兩種功能的酶。它們在識別位點(diǎn)之外切開DNA鏈，并且要求識別位點(diǎn)是反向重復(fù)序列；它們很少能產(chǎn)生完全切割的片段，因而不具備實(shí)用價值，也沒有人將其商業(yè)化。 二、II型限制性內(nèi)切酶 切割位點(diǎn)就在識別位點(diǎn)內(nèi)或其附近，是用于DNA 分析和克隆的一類。 限制酶和甲基化酶是各自獨(dú)立的兩個酶，例如 EcoRI的限制酶是相同亞基的二聚體，而其相 應(yīng)的甲基化酶為一單肽鏈。 由于兩條鏈上的切口位置不同�？梢杂姓承阅┒�(sticky ends或cohesive ends)和平齊末端(blunt ends或flush ends)。粘性末端可以是5'突出粘性末端，也可以是3'突出。 大部分這類酶都以同二聚體的形式結(jié)合到DNA上，因而具有嚴(yán)格的底物特異性，識別的是對稱序列一般為4bp-6bp的回文序列，但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識別非對稱序列。 也有少數(shù)酶能作用于與相應(yīng)的單鏈序列，但是，這種作用比對雙鏈識別位點(diǎn)的作用慢得多。拿研究較多的Ⅱ類限制酶HaeⅢ來說，兩種作用速度相差16倍。 識別序列的對稱性意味著這些位點(diǎn)的兩條DNA鏈上均有可被甲基化的堿基.實(shí)際存在的狀態(tài)有三種：全甲基化(兩條鏈上都有甲基化堿基)，半甲基化(只有一條鏈上有甲基化堿基)，非甲基化(識別位點(diǎn)上沒有甲基化堿基)。全甲基化的位點(diǎn)既不被限制;而半甲基化的位點(diǎn)也不被限制，但可以被修飾，成為全甲基化狀態(tài)。非甲基化的位點(diǎn)在體外試驗(yàn)中既可作限制酶的底物，又可作甲基化酶的底物；但在體內(nèi)可能主要被限制(即被限制酶切斷)。 在居民DNA上，都是全甲基化的。隨著DNA的復(fù)制，產(chǎn)生的子代DNA都是半甲基化的；但是不久，在復(fù)制過程中和復(fù)制結(jié)束后的短時間內(nèi)就完成了全甲基化過程。而外源DNA的命運(yùn)絕大多數(shù)是被限制，只有極少數(shù)能躲過限制作用而被修飾。 一些酶識別連續(xù)的序列（如EcoR I識別GAATTC）；而另一些識別不連續(xù)的序列（如Bgl I識別GCCNNNNNGGC）。限制性內(nèi)切酶的切割后產(chǎn)生一個3'羥基端和一個5'磷酸基團(tuán)。它們的活性要求鎂離子，而相應(yīng)的修飾酶則需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。這些酶一般都比較小，亞基一般都在200-300個氨基酸左右。 The numbers of bases will determine the frequency of that specific sequence in an average DNA sequence.  For example，  DpnI recognizes a 4 bp sequence with would occur once every 44 or 256 bp. PvuI recognizes a 6 bp sequence with would occur once every 46 or 4，096 bp. NotI recognizes an 8 bp sequence with would occur once every 48 or 65，536 bp. EcoR I G/AATTC Hind III A/AGCTT Hpa II/Msp I C/CGG Sal I G/TCGAC BamH I G/GATCC Smal I CCC/GGG Restriction enzymes can cut the DNA such that they leave a 5' overhang (BamHI)， a 3' overhand (PvuI)， or a blunt end with no overhang (DpnI). 同尾酶(isocaudomers) 有些來源不同的限制酶，識別及切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)出相同的粘性末端，這類限制酶稱為同尾酶。但兩種同尾酶切割形成的DNA片段經(jīng)連接后所形成的重組序列，不能被原來的限制酶所識別和切割。EcoRI和MunI屬于同尾酶。 同裂酶或同位酶(isoschizomers) 有些來源不同的限制酶卻識別和切割相同的序列，這類限制酶稱為同裂酶。Restriction endonucleases that recognize the same sequence are isoschizomers.識別位點(diǎn)相同，但切割位點(diǎn)不一定相同。 Ahl I A/CTAGT Spe I A/CTAGT Acc65 I G/GTACC Kpn I GGTAC/C 星號活性 (Star Activity)  在非理想的條件下，內(nèi)切酶切割與識別位點(diǎn)相似但不完全相同的序列，這一現(xiàn)象稱星號活性。有人提出，這種“星號”活性可能是內(nèi)切酶的一種普遍特性，如果提供給相應(yīng)反應(yīng)條件，所有內(nèi)切酶都會出現(xiàn)非特異性切割。 導(dǎo)致星號活性的因素： 較高的甘油濃度（>5% v/v）； 酶與底物DNA比例過高（不同的酶情況不同，通常為>100 U/µg）； 低鹽濃度（<25 mM） 高pH值（>pH 8.0） 存在有機(jī)溶劑（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等） 用其他二價離子替代鎂離子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等） 創(chuàng)造新的酶切位點(diǎn)(Generating New Sites) 補(bǔ)平5'突出的粘性末端，產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn) 通過計算機(jī)程序計算 連接兩個平末端，產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn) 連接互相匹配的粘性末端，產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn) Werner Aber：第一個描述限制性內(nèi)切現(xiàn)象；  Hamilton O. Smith 第一個純化并鑒定了這些酶的性質(zhì)；Daniel Dathans 用這些酶得到SV40 DNA的“物理圖譜”。 三人獲得1978年諾貝爾獎。RwO紅軟基地