這是熒光原位雜交ppt，包括了FISH的原理，F(xiàn)ISH的操作及應用，F(xiàn)ISH的展望，F(xiàn)ISH技術(shù)包括下列幾個步驟，探針的制備和標記，簡單重復序列探針，雜交信號的放大（適用于使用生物素標記的探針）等內(nèi)容，歡迎點擊下載。

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熒光原位雜交 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization， FISH) 熒光原位雜交是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術(shù)，以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導分子(reporter molecule)結(jié)合，雜交后再通過免疫細胞化學過程連接上熒光染料. 熒光原位雜交 FISH的基本原理是用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行特異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。 目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究等許多領(lǐng)域。。 原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點，諸如每次檢驗均 需重新標記探針，已標記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性，需要較和時間的曝光時間和對環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時，需要較多的分裂進行統(tǒng)計學分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計數(shù)上的誤 差等。 與之比FISH的優(yōu)點 ①操作操作簡便，探針標記后穩(wěn)定，一次標記后可使用二年 ②方法敏感，能迅速得到結(jié)果 ③在同一標本上，可同時檢測幾種不同探針. ④不僅可用于分裂期細胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究，而且還可用于間期細胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究. 缺點：不能達到100%雜交，特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。 FISH技術(shù)包括下列幾個步驟： 1）探針的制備和標記 2）探針及標本變性 3）雜交 4）洗脫 5）雜交信號的放大（適用于使用生物素標記的探針） 6）封片 7）熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果 探針的制備和標記 探針是一段帶有熒光色素或（半）抗原的核苷酸序列。其長度介于15至數(shù)千個核苷酸之間，但以250~650個核苷酸雜交效果最好 探針的熒光素標記可以采用直接和間接標記的方法。 間接標記是采用生物素標記DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進行檢測，同時還可以利用親和素-生物素-熒光素復合物，將熒光信號進行放大，從而可以檢測500bp的片段。 直接標記是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結(jié)合，或在缺口平移法標記探針時將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標記法在檢測時步驟簡單，但由于不能進行信號放大，因此靈敏度不如間接標記的方法。 （1）種類：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段 （2）應用 （a）定位DNA片段及嵌合體克隆驗證； （b）確定染色體微小缺失與重復； （c）染色體斷裂點分析。 （d）間期細胞染色體數(shù)目異常診斷。 單拷貝探針 單拷貝探針 簡單重復序列探針(simple repetitive probes)——異染色質(zhì)著絲粒探針(heterochromatic centromer probes) 其靶序列為α衛(wèi)星DNA或衛(wèi)星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色體的著絲粒和異染色質(zhì)區(qū)域，重復數(shù)百次至數(shù)千次。特點：信號強應用：(a)標記染色體識別 (b)染色體數(shù)目異常檢測 (c)間期細胞遺傳學研究和臨床診斷 簡單重復序列探針 簡單重復序列探針 間期細胞遺傳學的意義：細胞分裂期僅占整個細胞周期的幾分之一至幾十分之一，經(jīng)細胞培養(yǎng)和相應處理才能獲得染色體。人體的大部分細胞并不進行分裂，很難通過培養(yǎng)獲得中期染色體分裂相，間期FISH為這一時期遺期傳物質(zhì)的研究提供了可能，而且快速。 染色體涂染探針(chromosome painting probes) 整條染色體探針或染色體區(qū)帶特異性探針探針來源：（1）含有人單條染色體的人-嚙齒類(human-rodent)體細胞雜種組織融合的產(chǎn)物；（2）熒光激活的流式細胞儀(fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS)分離整條染色體DNA，并以載體克隆/PCR擴增；（3）顯微切割得到染色體或染色體片段，PCR擴增； 應用�。�1）染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常分析； �。�2）不同物種間的同源性比較； �。�3）白血病及其它腫瘤的染色體診斷和研究。 染色體涂染探針人類染色體結(jié)構(gòu)分析 染色體涂染探針：染色體結(jié)構(gòu)異常分析 多色FISH（muti-color FISH) 多色復合染色體FISH探針(multiplex FISH， M-FISH probes) 兩種以上不同的非同位素標記，不同的熒光檢測系統(tǒng)，通過不同的濾光片組合或極少數(shù)幾種非同位素標記探針后，按照不同的比例混合，可以顯示多種顏色。 多色復合染色體FISH探針 探針及標本的變性 1）探針變性 將探針在75oC恒溫水浴中溫育5min，立即置0oC，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。 2）標本變性 ①將制備好的染色體玻片標本于50oC培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標本需預先在固定液中退色后再烤片）。 ②取出玻片標本，將其浸在70～75oC的體積分數(shù)70％甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。 ③立即按順序?qū)�標本�?jīng)體積分數(shù)70％、體積分數(shù)90％和體積分數(shù)100％冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。 雜交 將已變性或預退火的DNA探針10μL 滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37oC雜交過夜（約15～17h）。 由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進行。 （1） 在玻片的雜交部位加150μL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37oC溫育20min。 （2） 去掉保鮮膜，再加150μL avidin-FITC于標本上，用保鮮膜覆蓋， 37oC繼續(xù)溫育40min。 （3） 取出標本，將其放入已預熱42～50oC的洗脫液中洗滌3次，每次5min。 （4） 在玻片標本的雜交部位加150μL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37oC溫育20min。 （5） 去掉保鮮膜，加150μL antiavidin于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37oC溫育40min。 （6） 取出標本，將其放入已預熱42～50oC的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。 （7） 重復步驟(1)、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。 （8） 取出玻片，自然干燥。 （9） 取200μL PI/antifade染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。 可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在-20～-70oC的冰箱中的暗盒中保持數(shù)月之久。 先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源。 FITC的激發(fā)波長為490nm。細胞被PI染成紅色， 經(jīng)FITC標記的探針所在的位置發(fā)出綠色熒光。 所用不同熒光材料的激發(fā)光和發(fā)射光波長及濾光鏡選擇 FISH技術(shù)的應用1）基因（或DNA片段）的染色體定位；2）染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常的檢測；3）間期細胞遺傳學（絨毛/羊水/精子/卵裂球/其它間期細胞研究與　　診斷）；4）腫瘤遺傳學研究 FISH的展望 FISH的展望 FISH技術(shù)和RFLP（Restrict Fragment Lenth Polymorphysim）結(jié)合，可以更精確地描述原必于染色體長短臂等結(jié)構(gòu)改變和染色體梳型或復制片段的性質(zhì)。 Thank you!ljW紅軟基地

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